建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1316

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (23): 3698-3704.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1316

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建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型及鉴定

丁燕，孟碧莹，向光大

(南方医科大学中国人民解放军中部战区总医院，湖北省武汉市 430700)

收稿日期:2019-01-30 出版日期:2019-08-18 发布日期:2019-08-18
通讯作者: 向光大，博士，主任医师，南方医科大学中国人民解放军中部战区总医院，湖北省武汉市 430700
作者简介:丁燕，女，1990年生，湖南省怀化市人，汉族，南方医科大学在读博士，医师，主要从事心血管、内分泌、基因敲除鼠的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81370896)，项目负责人：向光大

Establishment and identification of a mouse model of vascular endothelial cell knockout DEPTOR gene

Ding Yan, Meng Biying, Xiang Guangda

(General Hospital of Middle Theater Command of Chinese PLA of Southern Medical University, Wuhan 430700, Hubei Province, China)

Received:2019-01-30 Online:2019-08-18 Published:2019-08-18
Contact: Xiang Guangda, MD, Chief physician, General Hospital of Middle Theater Command of Chinese PLA of Southern Medical University, Wuhan 430700, Hubei Province, China
About author:Ding Yan, Doctoral candidate, Physician, General Hospital of Middle Theater Command of Chinese PLA of Southern Medical University, Wuhan 430700, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81370896 (to XGD)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
DEPTOR：含有DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(DEPTOR)，也称为含有DEP结构域的蛋白6(DEPDC6)，是人类中由DEPTOR基因编码的蛋白质。DEPTOR在调节血管内皮细胞活化，并且在体外促炎和血管生成反应中发挥重要作用。
血管内皮细胞DEPTOR基因敲除模型建立：利用Cre/loxp技术建立小鼠血管内皮细胞DEPTOR基因敲除模型，利用基因鉴定和蛋白水平验证敲除效果，初步观察敲除小鼠表型。

摘要
背景：目前关于DEPTOR与血管类疾病的研究较少，在动物体内研究尚未发现，因此建立一种新的血管内皮特异性敲除DEPTOR的小鼠模型对于研究DEPTOR与血管类疾病的关系尤为重要。
目的：建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠模型，并进行鉴定。
方法：Cre小鼠，DEPTORflox/+雄鼠，均购于美国Jackson实验室；C57野生型小鼠购自华中科技大学。实验方案经中国人民解放军中部战区总医院动物实验伦理委员会批准(批准号：20120034)。选取5只DEPTORflox/+雄鼠与10只DEPTOR flox/+雌鼠进行交配，得到基因型为EPTORflox/flox及DEPTORflox/+的F1子代小鼠35只，与8只血管内皮细胞特异性表达Tek+重组酶的Cre小鼠进行交配，一共得到基因型为Tek-Cre+×DEPTORflox/flox和DEPTORflox/flox子代小鼠共65只。采用PCR法进行DEPTORflox及Cre基因型鉴定，记录Tek-Cre+×DEPTORflox/flox小鼠与DEPTORflox/flox小鼠2月龄的体长及体质量，采用Western blotting法检测2组小鼠肝脏组织DEPTOR蛋白相对表达量，免疫荧光检测两组小鼠血管内皮细胞DEPTOR的表达。
结果与结论：①得到基因型为Tek-Cre+×DEPTORflox/flox小鼠共25只、DEPTORflox/flox小鼠共40只，其体长分别为(18.61±1.14)，(18.65±1.40) cm，体质量分别为(25.84±1.99)，(25.06±2.15) g，二者比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)；②Tek-Cre+×DEPTORflox/flox小鼠与DEPTORflox/flox小鼠肝脏组织DEPTOR蛋白相对表达量分别为0.28±0.02，0.82±0.04，二者比较P < 0.05；③血管内皮细胞DEPTOR阳染率分别为(73.67±2.87)%，(10.33±1.54)%，二者比较P < 0.05；④结果证实成功敲除了Tek-Cre+ × DEPTORflox/flox小鼠的血管内皮细胞的DEPTOR基因；说明成功构建了血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠模型，并经基因型及蛋白组织水平鉴定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2356-9924(丁燕)

关键词: 血管内皮细胞, 基因纯合子小鼠, Cre/loxp技术, DEPTOR基因, DEPTOR蛋白纯合子, 基因敲除

Abstract:

BACKGROUND: There are few studies on DEPTOR and vascular diseases, and no studies have been found in animals. Therefore, the establishment of a new mouse model of vascular endothelial specific knockout DEPTOR is important for studying the relationship between DEPTOR and vascular diseases.
OBJECTIVE: To establish and identify a mouse model of vascular endothelial cell knockout DEPTOR gene.
METHODS: Cre mice and DEPTORflox/+ mice were purchased from the Jackson Laboratory, and C57 mice were provided by Huazhong University of Science and Technology. The study was approved by the Animal Ethic Committee of General Hospital of Middle Theater Command of Chinese PLA, approval number: 20120034. Five DEPTORflox/+male mice were selected to mate with 10 DEPTORflox/+ female mice, and 35 F1 progeny mice with genotype of EPTORflox/flox and DEPTORflox/+ were obtained and mated with 8 vascular endothelial cells specifically expressing Tek recombinase Cre mice. Finally 65 mice with genotypes of Tek-Cre+ x DEPTORflox/flox and DEPTORflox/flox progeny were obtained. The DEPTORflox and Cre genotypes were identified by PCR, and the body length and body mass of Tek-Cre+ x DEPTORflox/flox mice and DEPTORflox/flox mice at 2 months were recorded. The expression of DEPTOR protein in the mouse liver tissues was detected by western blot assay, and immunofluorescence was used to detect the expression of DEPTOR in the mouse vascular endothelial cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were 25 Tek-Cre+ x DEPTORflox/flox mice and 40 DEPTORflox/flox mice, with the body length of (18.61±1.14) and (18.65±1.40) cm, respectively, and body mass of (25.84±1.99) and (25.06±2.15) g, respectively (both P > 0.05). (2) The relative expression level of DEPTOR protein in the Tek-Cre+ x DEPTORflox/flox mice and DEPTORflox/flox mice was 0.28±0.02 and 0.82±0.04, respectively (P < 0.05). (3) The number of DEPTOR-positive cell in vascular endothelial cells was 73.67±2.87 and 10.33±1.54, respectively (P < 0.05). (4) The results indicate that DEPTOR gene is successfully knocked out in Tek-Cre+ x DEPTORflox/flox mice. The homozygous mouse model of vascular endothelial cell knockout DEPTOR gene is successfully constructed and identified by genotype and protein tissue level.

Key words: vascular endothelial cells, DEPTOR mice, Cre/loxp technology, DEPTOR gene, DEPTOR homozygote, gene knockout

中图分类号:

丁燕, 孟碧莹, 向光大. 建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(23): 3698-3704.

Ding Yan, Meng Biying, Xiang Guangda. Establishment and identification of a mouse model of vascular endothelial cell knockout DEPTOR gene[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(23): 3698-3704.

图/表（结果） 4

2.1 DEPTOR^flox小鼠基因型鉴定结果 PCR电泳实验结果显示DEPTOR^flox/flox纯合子小鼠可见309 bp一条条带，DEPTOR^flox/+杂合子小鼠可见309和275 bp两条条带。结果经统计，共繁殖出DEPTOR^flox/flox纯合子小鼠19只，DEPTOR^flox/+杂合子小鼠16只。见图1。

2.2 Tek-Cre小鼠基因型鉴定结果 PCR电泳实验结果显示Tek-Cre⁺小鼠可见100 bp一条条带，Cre阴性的小鼠无此条带。见图2。

2.3 血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠的鉴定结果经PCR电泳实验结果统计共鉴定出基因型为Tek- Cre+×DEPTOR^flox/flox的小鼠25只、单纯的DEPTOR^flox/flox小鼠40只。见图3。经测量和称质量统计分析，2月龄的敲除鼠Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox与单纯DEPTOR^flox/flox的对照小鼠体长分别为(18.61±1.14)，(18.65±1.40) cm，t=0.119，P=0.905；体质量分别为(25.84±1.99)，(25.06±2.15)g，t=1.431，P=0.158。二者体长、体质量比较，差异无显著性意义(P均> 0.05)。

2.4 Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠与DEPTOR^flox/flox小鼠肝脏组织DEPTOR蛋白表达 Western Blot结果显示，Tek-Cre⁺ × DEPTOR^flox/flox小鼠与DEPTOR^flox/flox小鼠肝脏组织DEPTOR蛋白相对表达量分别为(0.28±0.02)、(0.82±0.04)，t=12.57，P=0.0001，二者比较P < 0.05；证实成功敲除Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠的血管内皮细胞DEPTOR基因，见图4。

2.5 Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠与DEPTOR^flox/flox小鼠胸主动脉DEPTOR免疫荧光染色结果 Tek-Cre⁺× DEPTOR^flox/flox和DEPTOR^flox/flox小鼠的胸主动脉进行CD31(表达在血管内皮细胞膜上)和DEPTOR(表达在细胞质中)的免疫荧光双染色，CD31是一种血管内皮细胞膜特异性的标志蛋白。染色结果发现在CD31染色的胸主动脉内皮细胞DEPTOR阳性个数表达中，Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠血管内皮细胞DEPTOR阳染个数明显低于DEPTOR^flox/flox小鼠，说明Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠成功在血管内皮细胞上敲除了DEPTOR基因，见图5。

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引言

血管生成是新血管从预先存在的血管中发芽的生理过程，血管生成异常见于良恶性肿瘤、脂质代谢紊乱和慢性炎症等^[1-3]，许多信号通路如 PGC-1α-ROS/NOS、LKB1- AMPK-AKT1、HIF-1α-VEGF-mTOC1以及PI3K/PTEN等与血管疾病关系密切^[4-8]。临床上采用了他汀类调节血脂、塞来昔布抑制血管迁移、中成药抑制血管内皮损伤等治疗^[9-14]，效果仍不是很理想，急需找到靶点特异性高、作用效果好的新型药物制剂。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号在调节细胞生长、代谢、增殖、凋亡中发挥了重要作用^[15-17]，mTOR参与体外血管内皮细胞增殖和迁移、伤口肉芽组织愈合、炎症刺激血管生成、肿瘤血管新生等^{[5-6，18-19]}，mTOR信号中TSC1基因缺失引发小鼠胚胎血管发芽障碍导致胚胎致死^[20]，其中含有DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(DEP domain- containing mTOR-interacting protein，DEPTOR)是mTORC1和mTOC2复合物的重要结合蛋白，抑制mTOR信号，其对血管发生和形成至关重要^[21-24]，DEPTOR在调节血管内皮细胞活化、体外促炎和血管生成反应中发挥重要作用^[25-27]。然而，DEPTOR在体内血管生成中的作用仍然知之甚少。

Cre/loxp条件性基因敲除技术主要是在特定的组织器官或特定细胞中进行靶基因灭活诱导相应的表型，利用常规基因组在特定靶位点上装上2个同向排列的序列，并用该两侧装接上loxP的(“loxP floxed”)的胚胎干细胞产生“loxP floxed”小鼠，再通过将“loxP floxed”小鼠与Cre转基因小鼠进行杂交^[28]，Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生特异性剪切，可以将特定的loxP序列和对应的靶基因进行切除^[29]。Cre的表达特性决定了靶基因的修饰持性，Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率，只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度^[30-31]。

此次研究首次将小鼠中引入特异性的Cre重组酶，产生血管内皮细胞靶基因发生特定方式修饰的条件性突变小鼠^[32-34]，在“DEPTOR floxed”小鼠的靶基因的两侧各自连接了一个loxP序列，但是靶基因编码的序列并没有发生其他的变化，故“DEPTOR floxed”小鼠表型仍同野生型的一样，在实验研究中可以用来做对照组，当“DEPTOR floxed”小鼠与Cre重组酶阳性的转基因小鼠进行杂交时，产生的子代中将同时带有“DEPTOR floxed”靶基因和Cre 两种基因，得到实验所需要的敲除鼠，具有创新性和重要的基础研究意义。

实验利用Cre/loxp条件性基因敲除技术构建血管内皮细胞特异性敲除DEPTOR基因小鼠模型，并进行基因水平和蛋白组织水平的鉴定，为研究DEPTOR基因在体内动物水平血管疾病相关的研究奠定基础，并观察敲除小鼠与对照小鼠的体质量、体长、存活率等表型，为进一步深入研究DEPTOR与血管疾病的分子机制进行铺垫。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物学体内实验。

1.2 时间及地点于2017年3月至2018年3月在南方医科大学中国人民解放军中部战区总医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：血管内皮细胞特异性表达Tek-Cre重组酶的小鼠(简称Cre小鼠，基因型为Tek-Cre⁺)8只，4周龄，4雌4雄，体质量(15.16±1.01)g；DEPTOR^flox/+雄鼠5只，4周龄，体质量(15.78±1.09)g；DEPTOR^flox/+雌鼠10只，4周龄，体质量(15.65±1.36)g，以上小鼠均购于美国Jackson实验室^[35]；C57野生型小鼠8只，6雌2雄，4周龄，体质量(15.83±1.03)g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。所有小鼠颜色均为黑色。饲养及繁殖条件：所有小鼠均饲养在华中科技大学实验中心SPF洁净的层流动物房内，室内温度为(25±2) ℃，湿度为55%-75%。

实验用主要试剂：DNTP试剂购自武汉拜意尔生物公司，Tag酶购自武汉巴菲尔公司，PCR引物均由上海生物工程有限公司合成，裂解液购自武汉华联科生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 DEPTOR^flox/flox纯合子小鼠的养殖及鉴定取8周龄的DEPTOR^flox/+雄鼠5只与8周龄的DEPTOR^flox/+雌鼠10只进行交配，繁殖出F1子代小鼠35只，颜色均为黑色。小鼠出生约2周，用眼科剪剪取约5 mm长的鼠尾，采用PCR法进行小鼠基因型的鉴定。鉴定方法如下：用洁净的眼科剪将鼠尾剪好放入编有号码的1.5 mL的EP管中，立即加入100 μL的裂解A液，15 000 r/min离心2 min 后，立即置入96 ℃金属水浴锅中水煮1 h；冷却后再加入100 μL的鼠尾裂解B液，15 000 r/min离心2 min。PCR引物序列：上游引物：5'-GGA AGT GAA GAC CTG TGA AGA TAA GAG-3'，下游引物：5'-CAG TCT AGA AAA GCA GAT AAC CCA AGTA-3'。PCR反应体系20 μL：2×PCR mix 10 μL，上游引物2 μL(调整终浓度100 nmol)，下游引物2 μL (调整终浓度100 nmol)，模板4 μL，dd超纯水2 μL。PCR反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环35次，4 ℃保存。在PCR上机反应结束后，取出模板DNA，用微量移液枪取8-10 μL DNA，在琼脂糖凝胶中进行电泳20-30 min，电泳结束后对琼脂糖凝胶进行成像系统拍照。

1.4.2 Tek-Cre小鼠的养殖及鉴定选择Cre小鼠8只与C57野生型小鼠8只进行交配，顺利繁殖出实验所需的F1子代Cre阳性小鼠8只。参照1.4.1的方法采用PCR法进行小鼠Tek-Cre基因型的鉴定。Tek-Cre引物序列：上游引物： 5′ -GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3′，下游引物：5′-GTG AAA CAG CAT TGC TGC CAC TT-3′。PCR体系 20 μL：2×PCR mix 10 μL，上游引物2 μL(调整终浓度 100 nmol)，下游引物2 μL(调整终浓度100 nmol)，模板 4 μL，dd超纯水2 μL。PCR反应条件：94 ℃、3 min， 94 ℃、30 s，51.7 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循环35次，4 ℃保存。参照1.4.1步骤的方法在琼脂糖凝胶中对模板DNA进行电泳及成像系统拍照。

1.4.3 血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠的繁殖和鉴定将19只DEPTOR^flox/flox小鼠、16只DEPTOR^flo^x/+小鼠分别与8只Cre小鼠进行交配，得到基因型为Tek-cre⁺×DEPTOR^flox/flox的小鼠和单纯DEPTOR^flox/flox小鼠共65只，其中基因型为Tek-cre⁺×DEPTOR^flox/flox的小鼠即为实验所需建立的血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠(knock out，KO)。参照1.4.1的方法鉴定65只子代小鼠的DEPTOR^flox及Cre基因型。

1.4.4 Western blotting法检测Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠与单纯DEPTOR^flox/fllox小鼠肝脏组织的DEPTOR蛋白表达取8周龄的Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠和DEPTOR^flox/fllox小鼠各3只，麻醉处死后取适量肝脏组织，放入编好号的EP管内，用眼科剪剪碎后加入适当的蛋白裂解液充分裂解均匀后，在100 ℃水浴锅中煮沸10 min后，用微量移液枪吸取10 μL各组的蛋白样品，用10%-PAGE凝胶中进行电泳一两个小时，将目标蛋白DEPTOR和内参GAPDH由凝胶转移到PVDF膜上后，在室温条件下摇床上用5%的脱脂奶粉封闭1 h，用眼科剪小心剪下PVDF膜中目标条带，分别加入兔抗DEPTOR(1∶2 000)、鼠抗GAPDH(1∶4 000)的一抗稀释液中，在4 ℃冰箱的摇床过夜。第2天，用1×TBST洗膜，每次5 min，洗涤3次后，在室温摇床上用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和抗鼠IgG二抗孵育1 h，1×TBST洗涤3次，每次5 min后在暗室进行胶片曝光显影，用胶片扫描仪扫描。GAPDH为内参，以DEPTOR蛋白与GAPDH灰度值的比值计算DEPTOR蛋白相对表达量。

1.4.5 免疫荧光法检测Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠与单纯DEPTOR^flox/fllox小鼠主动脉血管内皮细胞的DEPTOR蛋白表达取8周龄Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠和DEPTOR^flox/fllox小鼠各3只，麻醉处死后取主动脉血管组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋后切成4 μm的切片，按照标准步骤进行脱蜡水化后孵育羊抗小鼠的CD31(1∶200)和兔抗小鼠DEPTOR(1∶200)一抗，4 ℃过夜，洗涤3次后，在室温摇床上用山羊抗兔IgG和抗鼠IgG二抗孵育1 h，洗涤3次，DAPI显色后在荧光显微镜下拍照。

1.5 主要观察指标 ①DEPTOR^flox/flox纯合子小鼠和血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠的体长和体质量；②PCR基因鉴定结果；③小鼠的肝脏DEPTOR蛋白表达；④小鼠血管内皮细胞DEPTOR的免疫荧光表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

DEPTOR作为mTORC1和mTORC2复合物的重要组成成分，同时是mTORC1的重要抑制剂^[26，36]，与细胞增殖、炎症、肥胖和癌症密切相关^[37-43]，与血管形成及心血管疾病直接相关^[44-45]。研究报道DEPTOR调节血管EC活化，并在体外促进促炎和血管生成反应，导致血管形成障碍^[25]。心脏敲除DEPTOR基因的小鼠可以发生促进心肌细胞肥大^[35，46]。目前关于DEPTOR基因与血管疾病的研究多限于细胞和分子层面^[47]，血管内皮细胞特异性敲除小鼠的构建技术较为成熟^[48-49]，已经报道了在血管内皮细胞特异性敲除Cdc42基因对血管的黏附能力造成影响^[50]，Tie2-Cre表达细胞中的LKB1缺失缺血诱导的血管生成^[51]，但在血管内皮细胞敲除DEPTOR基因的小鼠模型还是首次构建，在动物整体水平来分析DEPTOR基因在血管形成和稳态功能中有重要意义。mTOR信号作为调控血管形成的重要信号分子，在血管的发育和稳态中发挥关键作用^[16]。DEPTOR作为mTOR复合物的抑制基因，在血管形成和调控中具有重要意义。因此，构建血管内皮细胞敲除DEPTOR基因的小鼠模型对于研究DEPTOR在血管疾病中功能十分重要。

实验结果发现基因型为DEPTOR^flox/flox的纯合子小鼠血管内皮细胞内及其他组织DEPTOR基因仍正常存在，因此可能对血管内皮细胞的功能产生影响。根据Cre/loxp条件性基因敲除技术原理，基因型为Tek-Cre⁺× DEPTOR^flox/flox的小鼠血管内皮细胞DEPTOR基因被敲除，而其他细胞及组织内的DEPTOR基因则正常存在。因此，构建基因型为Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox的纯合子小鼠对于研究DEPTOR基因在微血管中形成和稳态的调控作用具有重要意义。结果显示，通过Cre/loxp条件性基因敲除技术共繁殖出基因型为Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠25只、单纯DEPTOR^flox/flox小鼠40只，二者体长及体质量比较差异无统计学意义，说明血管内皮细胞敲除DEPTOR基因对小鼠的体质量和外形没有影响。Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠Cre基因鉴定结果可见 100 bp条带，说明其为Cre小鼠；DEPTOR^flox/flox基因鉴定结果只见309 bp条带，说明其为DEPTOR^flox/flox小鼠。因此，基因型为Tek-Cre⁺×DEPTOR ^flox/flox的小鼠即为此次实验所需建立的血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠，因为小鼠肝脏组织富含血管，此次研究选取肝脏组织作为蛋白敲除的检测标本，结果显示，Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠肝脏组织DEPTOR蛋白相对表达量明显低于单纯的DEPTOR^flox/flox小鼠的表达，且Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠血管免疫荧光结果显示血管内皮细胞DEPTOR阳性个数明显下降，证实成功敲除Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox小鼠血管内皮细胞的DEPTOR基因。

但是此次实验也存在实验条件和操作的局限性和不足，基因敲除小鼠的繁殖要求相对较高，实验室环境和人为因素容易干扰小鼠的繁殖，基因敲除小鼠的繁殖周期较长^[52-53]，得到血管内皮细胞特异性敲除DEPTOR基因的小鼠的时间较长，小鼠基因鉴定的要求较高，需要在基因和蛋白以及组织水平进行多方验证。此次研究只研究了特异性敲除小鼠与对照小鼠体长、体质量的表型差异，关于血管数量以及血管疾病造模等方面的表型还没有进行深入探索，在之后的研究中，将通过分子生物学以及组织学实验对小鼠的心脏、肝脏等器官的血管数量以及通过高脂造模观察两种小鼠血管内皮功能受损的情况，从而进一步深入探讨研究DEPTOR缺失与血管疾病的发生机制的关系，可能为血管相关疾病提供新的治疗机制和作用靶点。

综上所述，研究成功利用Cre/loxp技术构建了血管内皮细胞敲除DEPTOR基因纯合子小鼠模型，并成功鉴定出Tek-Cre⁺×DEPTOR^flox/flox的小鼠和DEPTOR^flox/flox小鼠的基因型，通过免疫印迹实验验证了敲除小鼠DEPTOR蛋白水平的降低，免疫荧光验证了血管内皮细胞DEPTOR组织水平表达降低。研究为进一步探讨血管内皮细胞敲除DEPTOR对血管形成中的作用，及其血管稳态调控的作用提供可靠的动物模型，奠定了体内动物实验的基础和平台。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型及鉴定

Establishment and identification of a mouse model of vascular endothelial cell knockout DEPTOR gene

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